Dense collagen/hyaluronic acid hydrogels for the development of a novel Annulus Fibrosus model by biofabrication
Hydrogels denses collagène/acide hyaluronique par biofabrication pour le développement d’un nouveau modèle in vitro d’Annulus Fibrosus
Résumé
The intervertebral disc degeneration is an irreversible pathology leading to low back pain. The intervertebral disc is composed of three tissues: the Nucleus Pulposus located in the center, surrounded by the Annulus Fibrosus (AF) and two cartilaginous plates located above and below. Disc degeneration is characterized by a hydration loss of the Nucleus Pulposus (NP), which becomes fibrous and no longer acts as a shock absorber. The forces exerted by the NP on the AF break it, causing the leakage of the NP leading to disc herniation. Several drug and surgical treatments have been developed but none stops or slows down the disc degeneration. This is due to a lack of knowledge of this disease. Most animal models are quadrupedal and do not reproduce the characteristics of the human pathology. This is why it is essential to develop novel in vitro models using human cells. Furthermore, biomaterials based on natural polymers are the most suitable for the development of three-dimensional in vitro models because these biopolymers are the natural support of cells. In order to mimic a complete intervertebral disc, it is essential to reproduce the three parts of this tissue. This thesis project aimed to develop a novel model of Annulus Fibrosus. For this purpose, two biopolymers present in the native tissue were selected: hyaluronic acid which gives hydration to the disc and collagen which is the natural support of cells. The first objective of this thesis was devoted to the formulation of a printable ink to reproduce the AF extracellular matrix. To do this, a physicochemical study was carried out on collagen/hyaluronic acid (HA) interactions. After mixing, these two biopolymers form polyionic complexes (PICs) and precipitate due to their opposite charges. So, a homogeneous ink cannot be obtained. Inhibition of PICs formation is effective at very acidic pH (pH 1) in with salt addition. Nevertheless, these conditions are incompatible with cell survival. By modulating the pH and ionic strength, we discovered a new method to formulate a homogeneous collagen/HA ink. Using a collagen solution close to its isoelectric point (pH 5.5) in presence of NaCl, we triggered the formation of collagen fibrils in solution. Interactions with HA are inhibited in these conditions and PICs are not formed anymore. Then, a fibrillary collagen hydrogel can be formed by raising the pH to 7 and HA can be crosslinked to obtain hydrogels with optimized physical properties. The second objective was to design the in vitro model of Annulus Fibrosus. Since AF is an anisotropic tissue, we 3D printed dense collagen solutions to induce alignment. Indeed, the shearing of dense solutions during printing aligns collagen. Two strategies were tested in this study. (i) The ink previously formulated was used at high concentration (30 mg.mL-1 for collagen, 7.5 mg.mL-1 for HA) with a 4:1 collagen/hyaluronic acid ratio to resemble the native AF. This ink was printed in a gelation bath (2X PBS, 10-3M NaOH) and photocrosslinked under green light (eosin Y used as photo initiator). (ii) A second ink was used, only composed of concentrated collagen and printed in the same gelling bath. Then, an impregnation process with HA was carried out followed by the photocrosslinking with green light. The two methods allowed the production of anisotropic lamellae with structural features resembling those of AF as well as interesting rheological properties (G' = 6kPa). These lamellae were cellularized with fibroblasts confined between two printed layers. Cell viability and morphology were similar to that observed within the native tissue. If the physiological mechanical properties were not reached, biocompatibility, bioactivity, structure and anisotropy of these biomaterials were close to the native tissue, this allows to validate them as a novel 3D model of Annulus Fibrosus.
La dégénérescence du disque intervertébral est une pathologie irréversible entraînant des maux de dos intenses. Les disques intervertébraux sont composés de trois parties : le Nucleus Pulposus (NP) situé au centre, entouré par l’Annulus Fibrosus (AF) et deux plateaux cartilagineux de part et d’autre. La dégénérescence du disque est caractérisée par une baisse d’hydratation du NP qui devient fibreux et ne joue plus son rôle d’absorbeur de chocs. Les forces exercées par le NP sur l’AF vont le rompre provoquant l’écoulement du NP ce qui génère une hernie discale. De nombreux traitements ont été développés mais ils ne permettent pas de freiner la dégénérescence du disque. Ceci est dû en partie à une méconnaissance de la maladie. La plupart des modèles animaux sont quadrupèdes et ne reproduisent pas les caractéristiques de la pathologie humaine. C’est pourquoi il est essentiel de développer de nouveaux modèles in vitro utilisant des cellules humaines. De plus, des biomatériaux à bases de polymères naturels semblent être les plus adéquats pour le développement de tels modèles car ils sont le support naturel des cellules. Ce projet de thèse a eu pour but de développer un nouveau modèle d’Annulus Fibrosus. Pour cela, deux biopolymères présents dans le tissu natif ont été sélectionnés : l’acide hyaluronique qui apporte l’hydratation au disque et le collagène qui sert de support aux cellules. Dans un premier temps, une encre imprimable reproduisant la matrice extracellulaire de l’AF a été développée. Pour cela, une étude physicochimique a été effectuée sur les interactions collagène I/acide hyaluronique (HA). Lorsqu’ils sont mélangés, ces deux biopolymères forment des complexes poly-ioniques (CPIs) du fait de leurs charges opposées. Ces CPIs précipitent et ne permettent pas d’obtenir une encre homogène. L’inhibition des CPIs est efficace à des pH très acides (pH 1) en présence de sels mais ces conditions sont incompatibles avec la survie cellulaire. En modulant le pH et la force ionique, nous avons découvert une nouvelle méthode pour formuler une encre collagène/HA homogène. En se plaçant proche du point isoélectrique du collagène (pH 5,5) et en présence de NaCl, des fibrilles de collagène se forment en solution. Dans ces conditions, les interactions avec l’HA sont inhibées et les CPIs ne se forment pas. Il est ensuite possible de former des hydrogels de collagène fibrillaire par remontée de pH à 7 et de photo réticuler l’HA pour obtenir des hydrogels avec des propriétés physiques optimisées. Le second objectif était de générer le modèle in vitro d’Annulus Fibrosus. L’AF étant un tissu anisotrope, nous avons procédé à une impression 3D de solutions denses de collagène pour induire son alignement. Deux stratégies ont été adoptées pour cette étude. (i) L’encre précédemment formulée en phase diluée a été utilisée à plus haute concentration (30 mg.mL-1 en collagène, 7,5 mg.mL-1 en HA) avec un ratio collagène/HA de 4 pour 1 comme c’est le cas dans l’AF natif. Cette encre est imprimée en bain de gélification (PBS 2X, NaOH 10-3M) et photo-réticulée sous lumière verte en présence d’éosine Y. (ii) Une seconde encre a été formulée composée de collagène concentré imprimée dans le bain de gélification. Après imprégnation avec l’HA, la photoréticulation a été effectuée. Les deux méthodes ont permis d’obtenir des lamelles d’hydrogels anisotropes avec une structure ressemblant à celle de l’AF et des propriétés rhéologiques intéressantes (G’ = 6kPa). Ces lamelles ont été cellularisées avec des fibroblastes en reproduisant leur environnement natif confiné entre deux couches imprimées. La viabilité cellulaire et la morphologie des cellules étaient similaires à celles observées dans le tissu natif après 14 jours de culture. Si les propriétés mécaniques n’ont pas été atteintes, la bioactivité, la structure et l’anisotropie des matériaux développés lors de cette thèse ont été proches du tissu natif, les validant en tant que modèle 3D de l’Annulus Fibrosus.
Origine : Version validée par le jury (STAR)